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    如何做非肌肉肌球蛋白的層析純化？

    發(fā)布時間： 2021-11-24　　點擊次數： 883次

    材料與儀器

    非肌肉肌球蛋白
    勻漿緩沖液 肌動蛋白聚合緩沖液 凝膠過濾 羥基磷灰石緩沖液 GF HT 緩沖液
    大容量轉頭

    步驟

    高速離心和 DEAE 層析

    1. 用不含除了 PMSF 以外的蛋白水解抑制劑的勻漿緩沖液平衡 DEAE 纖維素，取 50 ml 裝到 2.5cm x 35cm 有合適管路的柱子上。

    2. 準備總體積為 0.8 L，線性梯度為 0~0.5 mol/L KCl 的勻漿緩沖液。

    3. 用大容量轉頭（例如 Ti 647.5，它帶 6 個 70 ml 容量的聚碳酸酯桶）以 43000 r/min，137600 g 超速離心 2 小時，從已勻漿的細胞中沉淀細胞碎片。

    4. 盡可能多地轉移清亮的上清，不要弄碎沉淀和浮在表面的白色脂肪殘渣。

    5. 混合 100 ml 上清和 100 mI DEAE-纖維素（已如上所述用勻漿緩沖液預先平衡）可以一次性地把清亮的上清樣到 DEAE 上。DEAE-蛋白混合物倒進 2.5cm x  35cm 的預先裝了 50 ml 用勻漿緩沖液和 PMSF平衡的 DEAE-纖維素的柱子。

    6. 立即開始分部收集（每管 8.5 ml )。

    7. 用 3~5 倍體積的勻漿緩沖液洗柱子，用 0.8~1 升 KCl 梯度為 0~0.5 mol/L 的勻漿緩沖液進行洗脫。

    8. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性（K+EDTA 或 Ca2+ 活性峰）、SDS-PAGE、免疫印跡、ELASA 或放射標記及固相結合分析.

    9. 把從 DEAE 層析得到的含肌球蛋白的收集液混合在一起。

    非肌肉肌球蛋白和外源肌肉肌動蛋白共沉淀

    10. 準備下列貯存液。

    1 mol/L KCl

    0.1 mol/L MgCl2

    溶于不含 ATP 的肌動蛋白聚合緩沖液的 30% 蔗糖墊層：

    300 mg/ml 蔗糖

    50 mmol/L KCl

    2 mmol/L MgCl2

    10 mmol/L 嘧唑-HCl，pH 7.0

    11. 計算所需的外源肌動蛋白量，使混合的 DEAE 收集液中肌動蛋白的終濃度為 0.125 mg/ml。所需肌動蛋白體積(ml)由下式給出：

    VA= ( 0.125 x Vpool）/ [ ( 肌動蛋白）-0.125]

    ( 肌動蛋白）是在緩沖液 A 中 G-肌動蛋白貯存液的濃度，單位 mg/ml。

    12. 量出所需 G-肌動蛋白的量（使用 1~8 mg/ml 溶于緩沖液 A 中的肌動蛋白，用肌動蛋白制備中所述的方法獲得），并通過和適當體積的 50x 肌動蛋白聚合緩沖液（所加的體積=VA/50）混合并在室溫培養(yǎng) 10~20 分鐘來使它聚合。

    50x 肌動蛋白聚合緩沖液：

    2.5 mol/L KCl

    1 mol/L MgCl2

    3 mmol/L NaN3

    13. F-肌動蛋白和 DEAE 收集液混合（步驟 9 )，使 MgCl2 濃度為 2 mmol/L。

    14. 加入足量的 1 mol/L 葡萄糖使終濃度為 50 mmol/L ( 加 50 μl/ml )，然后加己糖激酶使終濃度為 1 單位/ml（0.25 μl/ml）。室溫下攪拌 5 分鐘，然后轉移到 0℃ 過夜（幾小時可能就足夠了）。

    15. 在超速離心管中裝 1/3 溶于不含 ATP 的肌動蛋白聚合緩沖液的 30% 蔗糖墊層，把含僵硬的肌動球蛋白復合物的樣品鋪到墊層上面。離心 3 小時沉淀肌動球蛋白。

    通過不連續(xù)凝膠過濾從外源肌動蛋白中分離肌球蛋白

    16. 準備用于凝膠過濾的貯存液和材料

    4x 凝膠過濾/羥基磷灰石緩沖液：

    200 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

    20% 蔗糖

    8 mmoI/L K+EDTA，pH 7.0

    12 mmol/L NaN3

    可以貯存在 4℃。

    2x GF/HT 緩沖液：

    4X GF/HT 緩沖液，100 ml

    0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0，10 ml   

    DTT，62 mg

    用 dH2O 加到 200 ml 。

    KI 凝膠過濾緩沖液：

    2x GF/HT 緩沖液，20 ml

    Kl，4.78 g

    用 dH2O 加到 40 ml。

    KCl 凝膠過濾緩沖液：

    2x CF/HT 緩沖液，180 ml

    KCl，16.10 g

    用 dH2O 加到 360 ml。

    17. 備一個 1.5 x 85 cm 的用 KCl 凝膠過濾/羥基磷灰石緩沖液平衡了的 A15-m 瓊脂糖凝膠過濾柱。

    18. 離心步驟結束的時候，在凝膠過濾柱上加 12~19 ml KI 緩沖液。

    19. 倒掉上清和蔗糖，留下肌動球蛋白沉淀物，然后在冰庫中把管子倒轉在紙巾上 5~10 分鐘，小心地使液體流干。用棉簽去掉多余的液體。

    20. 處理沉淀：

    (1) 用不銹鋼刮刀挖出沉淀。

    (2) 在 4.3 ml KI 緩沖液中用一個 7 ml 的帶緊的研杵的 Dounce 勻漿器進行勻漿。

    (3) 超速離心（50Ti 轉頭，30000 r/min 63400 g）30 分鐘使樣品變清。

    (4) 仔細地轉移上清，不要帶任何沉淀碎片。

    (5) 立即把樣品加到凝膠過濾柱上并用 KCI 凝膠過濾緩沖液跑柱子。

    21. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性、SDS-PAGE、免疫印跡、ELASA 或放射標記及固相結合分析?；旌虾∏虻鞍椎氖占骸Ｏ疵撎烊患∏虻鞍?II 的分配系數應該是 0.13~0.14。

    羥基磷灰石層析

    22. 準備進行羥基磷灰石層析的貯存液和材料。

    預先在 GF/HF 緩沖液中平衡了的羥基磷灰石（2~4 ml）

    線性梯度，總體積 20~40 ml 的 GF/HF 緩沖液，0~300 mmol/L K+PO4，pH 7.0

    0.6 mol/L K+PO4，pH 7.0

    23. 準備一個 1x 5 cm 的有合適管路的柱子。

    24. 對收集液的進一步純化是重復肌動蛋白親和及凝膠過濾步驟或接著用經基磷灰石層析。

    25. 收集液和預先平衡好的羥基磷灰石（每毫升羥基磷灰石 12~20 ml 收集液）混合在一起，然后旋轉培養(yǎng)過夜（短一點時間可能也夠）。

    26. 把蛋白/羥基磷灰石混合物倒到一個小柱子（1x5 cm) 中，用 5~10 倍體積的 CF/HF 緩沖液洗，然后用總體積 20~40 ml 的 GF/HF 緩沖液，0~300 mmol/L K+PO4 線性梯度，pH 7.0 洗脫。肌球蛋白Ⅱ在大約 200~220 mmol/L K+PO4，pH 7.0 處洗脫下來。


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