1. 抗原的密度

①　高表達的抗原可選擇幾乎所有的熒光素；

②　低密度表達的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素如PE/APC。

2. 自發(fā)熒光

①　每種細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光；

②　所有的熒光通道均可觀察到自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光強度在波長較長時迅速降低；

③　對自發(fā)熒光較強的細(xì)胞，選擇發(fā)射波長較長的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值；

④　對自發(fā)熒光比較弱的細(xì)胞，發(fā)射波長較長的熒光素對S/N提高沒有明顯的改善。可選用FITC。

3. 非特異結(jié)合

①　許多熒光抗體可產(chǎn)生低水平的非特異結(jié)合，使陰性細(xì)胞群的熒光超出自發(fā)熒光；

②　非特異結(jié)合由下列因素引起：

單克隆抗體的同型抗體：一些IgG同型抗體可能與一些細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合；

所用的熒光素：羰花青染料（如CY3、CY5、CY5.5、CY7）和Tex-Red直標(biāo)的抗體及一些復(fù)合染料標(biāo)記的抗體在標(biāo)記某些亞群的細(xì)胞時有時會提高結(jié)合率；對CY5來說，是因為該染料與低親和力Fc受體的極低親和力相互作用。這也是復(fù)合染料PE-CY5的特性。

4. 復(fù)合染料：小心信號衰退

①　復(fù)合染料因為光、固定劑或溫度升高會致信號衰退，是復(fù)合染料在上一級染料處發(fā)光。該種現(xiàn)象從一小部分亞群開始，導(dǎo)致APC或PE染色細(xì)胞群假陽性；

②　減少樣本暴露于光、高溫或固定劑，可很大程度上避免這一問題；

③　選擇染料時需要考慮：復(fù)合染料的信號衰退會不會降低APC或PE的靈敏度。如果是，就要選擇另外的試劑搭配；

④　如果樣本需要固定，要選擇穩(wěn)定的固定劑，可有效阻止復(fù)合染料的信號衰退。

5. 熒光信號之間的干擾，會增加信號檢測背景

①　熒光信號強細(xì)胞群體的SD比熒光信號弱的細(xì)胞群體大；

②　多色分析時，一種熒光素（如FITC）的光會漏入相鄰的熒光素（如PE）的檢測器。漏入的光越多，需要補償?shù)脑蕉?，對分辨率的影響就越大。尤其是弱表達的信號。

6. 盡量減少熒光信號之間的干擾

①　檢測的顏色越多，面臨的熒光信號之間的干擾越多；

②　選擇試劑組合時盡可能降低熒光發(fā)射波長之間的重疊。

7. 儀器配置的差異，多色分析不可能全選“最亮"的熒光素，但對于特定的一款儀器，可以根據(jù)熒光的強弱列出可選的染料。

8. 亮度的判斷：就是熒光染料的靈敏度，區(qū)分背景和弱陽性信號的能力。

9. 影響背景的因素有檢測器的電子噪音、細(xì)胞自發(fā)熒光、來自其他檢測器的信號干擾，這些因素也增加了陰性熒光峰的寬度（標(biāo)準(zhǔn)差）。

10.靈敏度好的標(biāo)準(zhǔn)是染色指數(shù)：D/W，D指的是陽性峰與陰性峰的平均熒光強度的差；W是陰性峰的2SD。