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    牙簽法小量制備質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時(shí)間： 2021-12-24　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1517次

    原理

    用牙簽從瓊脂培養(yǎng)基上挑取的菌落可直接用于制備質(zhì)粒 DNA。所得的閉合環(huán)狀 DNA 往往雜質(zhì)太多，不能作為大多數(shù)限制酶的底物。

    材料與儀器

    抗生素 溴酚藍(lán)溶液 EDTA 溴化乙錠 NSS 溶液 KCl 瓊脂糖凝膠
    LB、YT 或 SOB 熱循環(huán)儀 木質(zhì)牙簽

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液和溶液

    (1) 用于篩選質(zhì)粒的抗生素

    (2) 溴酚藍(lán)溶液（0.4%，m/V）或甲酚紅溶液（10 mmol/L）

    (3) EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0 )

    (4) 溴化乙錠（10 mg/ml ) 或 SYBR Gold

    (5) KCl ( 4 mol/L)

    (6) NSS 溶液：0.2 mol/L NaOH，0.5% SDS，20% 蔗糖。

    2. 凝膠

    (1) 瓊脂糖凝膠（0.7%，5 mm 厚），用不含溴化乙錠的 Tris-乙酸鹽或 Tris-乙酸鹽緩沖液配制及電泳。

    當(dāng)質(zhì)粒大小只有很小的差別時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳應(yīng)使用 Tris-硼酸鹽電泳緩沖液（TAE），因?yàn)樗芙獠煌笮〕菪?DNA 的能力更強(qiáng)。否則應(yīng)使用 Tris-硼酸鹽-EDTA ( TBE）緩沖液，因?yàn)樗懈鼜?qiáng)的緩沖能力。

    (2) 瓊脂糖凝膠

    3. 培養(yǎng)基

    (1) LB、YT 或 SOB ( 用于培養(yǎng) E.coli 的高營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基）

    (2) LB、YT 或含適當(dāng)抗生素的 SOB 瓊脂平板

    4. 專用設(shè)備

    (1) 熱循環(huán)儀

    (2) 調(diào)至 70℃ 的水浴

    (3) 木質(zhì)牙簽

    二、方法

    1. 細(xì)胞的制備

    (1) 在含適當(dāng)抗生素的富養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 ( LB、YT 或 SOB ) 上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了適當(dāng)質(zhì)粒的菌落， 直到它們的直徑長至 2~3 mm ( 對(duì)于大多數(shù)菌株，需在 37℃ 下培養(yǎng)約 18 ~24 h )。

    (2) 用無菌牙簽或一次性小環(huán)將細(xì)菌菌落的一小塊轉(zhuǎn)移到含適當(dāng)抗生素的一條或一小塊瓊脂母板上，將該菌落的剩余部分轉(zhuǎn)移到已編號(hào)的微量離心管中，管內(nèi)含有 50 μl 無菌的 10 mmol/L EDTA ( pH 8.0 )。

    除待實(shí)菌落外，還應(yīng)轉(zhuǎn)移幾個(gè)“空" 菌落（不含外源基因的質(zhì)粒載體）。這幾個(gè)樣品可在凝膠電泳中用做分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物。

    (3) 重復(fù)步驟 2，直到收獲預(yù)期數(shù)目的菌落。

    (4) 當(dāng)所有菌落都被復(fù)制和轉(zhuǎn)移之后，將母板在 37℃ 培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)后于 4℃ 保存，直到得到凝膠電泳結(jié)果。然后從母板上收獲其質(zhì)粒為預(yù)期大小的菌落。

    (5) 在培養(yǎng)母板的時(shí)候，對(duì)細(xì)菌懸液進(jìn)行以下的處理；在每一微量離心管中順序加入 20 μl 新配置的 NSS 溶液。蓋上管蓋，振蕩混勻 30 s。

    (6) 將所有離心管轉(zhuǎn)移到 70℃ 熱水浴中放置 5 min，然后于室溫冷卻。

    (7) 在各管中加入 1.5 μl 的 4 mol/L KCl 溶液，振蕩混勻 30 s。

    (8) 將離心管在冰上放置 5 min。

    (9) 在 4℃ 下以最大速度離心 3 min 以除去細(xì)菌碎片。

    2. 質(zhì)粒的凝膠電泳分析

    (1) 將上清依次轉(zhuǎn)移到潔凈離心管中。如果只用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品，在每管中加入 0.4% 的溴酚藍(lán)溶液；如果既要用瓊脂糖電泳又要用 PCR 分析，則在樣品中加入 2 μl 10 mmol/L 甲粉紅。在 0.7% 的瓊脂糖凝膠（5 mm 厚）的加樣孔（5 mm 長，2.5 mm 寬）中加 50 μl 上清。

    瓊脂糖凝膠不含溴化乙錠，且所用的緩沖液也不含溴化乙錠，因?yàn)檫@樣超螺旋 DNA 的遷移率比插入染料后更準(zhǔn)確地反映其分子質(zhì)量。這就能更容易地區(qū)分不同大小的質(zhì)粒。

    (2) 當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到膠的 2/3 或 3/4 處，或甲酚紅遷移到膠的一半時(shí)，室溫下將膠浸在溴化乙錠溶液（0.5 μg/ml 的水溶液）中染色 30~45 min。在紫外燈下觀察凝膠并拍照。

    (3) 如果在 (1) 中使用甲酚紅，則宜用 PCR 方法分析上清 ( 用各樣品的剩余液作為模板 )。

    甲酚紅（Merk Index 公司）在酸性溶液中是橙色到琥珀色的，pH 為 7.2 時(shí)是黃色的，在堿性溶液中是紅色的。與溴酚藍(lán)和二甲苯藍(lán)不同，甲酚紅不抑制 DNA 聚合酶（Taq 聚合酶，從嗜熱古細(xì)菌中提?。┑臒岱€(wěn)定性（Hoppe et al. 1992 )。因而，含甲酚紅的 DNA 溶液在大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)中可用。此染料在 2% 的瓊脂糖凝膠中的遷移位于在二甲苯藍(lán)和溴酚藍(lán)之間，大小大約相當(dāng)于 300 bp ( Hoppe et al. 1992 )。在瓊脂糖凝膠電泳照片上，甲酚紅不會(huì)產(chǎn)生像溴化乙錠染色一樣的陰影。

    (4) 將母板上可能含有重組子的菌落接種到含適當(dāng)抗生素的 2 ml 液體培養(yǎng)基（LB、YT 或 SOB ) 中，進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)。

    不需要等到母板上的菌落長到很大。細(xì)菌即使只是薄薄的一層，也足夠接種用。

    (5) 用此小規(guī)模培養(yǎng)物小量制備待測的重組子質(zhì)粒。用酶切及瓊脂糖電泳分析質(zhì)粒 DNA，以確證其大小和結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致。

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