01
為什么我需要傳代我的細胞？
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細胞的必須檢查，你有做過嗎？
發(fā)布時間： 2022-01-04 點擊次數(shù)： 1016次文章描述了一個典型的工作流程，與細胞操作需要注意的必要步驟，為了成功地應用哺乳動物細胞系，它們必須在受控的條件下生長，并需要自己特定的生長介質(zhì)。此外，為了保證一致性，必須定期監(jiān)測它們的生長情況。當細胞系達到約80%的合流時，必須傳代培養(yǎng)，以確保細胞的正常生長和健康。80%的重合性是指培養(yǎng)容器表面的80%被細胞覆蓋。
細胞培養(yǎng)一旦開始，由于細胞數(shù)量的增加、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有毒代謝物的增加，它不能無限期地生長，最終導致細胞死亡。此外，研究人員通常對細胞要進行多次實驗，因此不希望一次用完所有的細胞。傳代或分裂細胞，通過去除培養(yǎng)基和轉移細胞到新鮮的生長培養(yǎng)基，細胞被給予新鮮的營養(yǎng)同事有毒的代謝物也被去除，細胞就會被賦予新的活力繼續(xù)生長。
02
細胞生長曲線
細胞在培養(yǎng)液中的生長曲線由四個階段組成:生長開始前的潛伏期(滯后期)，指數(shù)生長期(對數(shù)期)，細胞數(shù)量快速增長逐漸放緩的平穩(wěn)期和細胞死亡的死亡期，這是因為缺乏營養(yǎng)和錯誤的生存條件。在對數(shù)期應更換培養(yǎng)基，細胞在到達固定期前應進行傳代，如圖1.
圖一
所以培養(yǎng)細胞的同學請注意：
為了保持細胞的健康和積極生長，有必要更新生長培養(yǎng)基，并定期傳代。根據(jù)細胞類型的不同，培養(yǎng)基在對數(shù)期可以發(fā)生幾次改變。傳代細胞的最佳時間是在對數(shù)期和固定期之間，即細胞達到合流之前。
一. 為什么用胰酶傳代細胞？
準備細胞進行傳代培養(yǎng)的最常見方法是用胰蛋白酶等蛋白水解酶破壞細胞間的細胞與底物的連接。胰蛋白酶與乙二胺四乙酸(EDTA)結合會導致細胞從生長表面脫離。胰蛋白酶切斷將細胞固定在培養(yǎng)皿上的局部粘連，EDTA作為鈣螯合劑。
通過去除鈣，參與細胞間相互作用的鈣粘蛋白被破壞，細胞彼此分離。一旦從生長表面和周圍細胞分離，就可以很容易地分離并在新的細胞培養(yǎng)皿中生長。
細胞培養(yǎng)條件和傳代培養(yǎng)方法因細胞類型而異。圖2描述了細胞培養(yǎng)過程中的基本步驟。在整個培養(yǎng)過程中，在一個無污染的環(huán)境中工作是很重要的。在開始、胰蛋白酶化、細胞計數(shù)和分裂后都要檢查細胞。為了取得一致的結果，保持良好的記錄和文件也很重要。
圖二
二. 3個步驟確定細胞是否能夠傳代
①. 將細胞從培養(yǎng)箱中取出，置于顯微鏡下進行快速細胞檢查。細胞應該每天在顯微鏡下檢查，以確保它們是健康的(沒有污染，很少死細胞)和生長如預期。
②. 細胞應主要附著在培養(yǎng)皿或燒瓶的底部，而培養(yǎng)基應是粉橘色。pH值指示物酚紅在酸化時變成黃色，這個時候需要注意了 ，有兩種情況 一是細胞的密度過大，已經(jīng)到了生長平頂期，二是細胞里有污染物。
③. 用顯微鏡拍照，記錄好細胞狀態(tài)對于保證實驗結果的一致性非常重要。
三. 傳代我的細胞
①. 移液器將培養(yǎng)基從細胞皿移到廢物容器中。用5ml不含鈣和鎂的預加熱PBS仔細清洗細胞多達三次，以去除殘留培養(yǎng)基中的胎牛血清(FBS)。胎牛血清會抑制胰蛋白酶。
②. 加入相應規(guī)格的預溫胰蛋白酶/EDTA ，比如：T25瓶 1-2ml左右，輕輕旋轉以覆蓋培養(yǎng)皿底部的所有細胞。
③. 將細胞在37°C孵育2-3分鐘或者室溫3-5分鐘使其分離。不同的細胞系需要不同的胰蛋白酶孵育時間。為避免過度胰蛋白酶作用損傷細胞，每隔2分鐘在顯微鏡下檢查一次。待細胞變得橢圓透亮后，caco-2/hepG2細胞邊緣開始漂浮時，加雙倍以上*培養(yǎng)基中和，將細胞懸浮液轉移到15ml的試管中，并以1000轉/分旋轉5min。
④. 抽吸上清，加2ml*培養(yǎng)基重懸細胞，分瓶或者凍存。
四. 細胞計數(shù)：
①. 將100µL細胞懸液與等量的0.4%臺盼藍溶液混合。臺盼藍可以選擇性地穿透死細胞的細胞膜并將其染成藍色，但不會被活細胞吸收。將蓋片置于計數(shù)面上，準備血細胞計。
②. 將移液管尖的一端置于蓋玻片邊緣，將細胞懸浮液裝入計數(shù)室(每個計數(shù)面積約為4µl)，輕輕排出細胞懸浮液。蓋層下的區(qū)域通過毛細作用而淤塞。在大多數(shù)情況下，腔室有兩個計數(shù)區(qū)，可以獨立加載。
③. 將腔室置于顯微鏡臺上，聚焦細胞。計數(shù)柵的方形圖案因腔體類型的不同而不同。你在這里看到的?？怂?羅森塔爾計數(shù)室有16個面積為一平方毫米的區(qū)域，每個區(qū)域由三道線圍成。每個方塊又被分成16個更小的方塊。計算一個16平方區(qū)域中的所有單元格，如圖所示。為了避免在區(qū)域的邊緣計算兩次單元格，只計算正方形兩邊直線上的那些單元格。在本例中，應計算觸及左上界限的單元格(較粗的紅線)。細胞觸及的下限值和右限值不應被考慮在內(nèi)。將活細胞和死細胞按5個一平方毫米的矩形計數(shù)。為了進行計算，您需要將所有5個正方形的計數(shù)結果結合起來。為了提高測量精度，還可以計算計數(shù)室的額外平方.
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