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    原代細胞培養(yǎng)

    發(fā)布時間: 2022-10-18  點擊次數(shù): 1192次

    簡介


    細胞培養(yǎng)是指將細胞從動物或植物體內(nèi)取出,然后在適宜的人工環(huán)境中生長的過程。細胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過酶或機械方法進行解離,也可以來源于已建立的細胞系或細胞株。包括原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。

    原代與細胞系培養(yǎng)比較
    類型優(yōu)點缺點
    原代細胞培養(yǎng)

    非變異的、非永生化的細胞;

    具有更好的生理相關性,各方面更接近體內(nèi)狀態(tài);

    具有一定的生命周期

    培養(yǎng)周期長、不同批次細胞差異大、培養(yǎng)原代細胞花費更高
    細胞系培養(yǎng)

    相對便宜,可以無限傳代;

    培養(yǎng)周期短,短時間可以獲得大量細胞

    發(fā)生異倍化,細胞生理活性等相關性能和正常細胞差異較大,不能真實反應原始細胞生理狀態(tài);


    原理


    鼠胚原代培養(yǎng)是原代培養(yǎng)一個類型,是指從孕鼠中剖取適宜胎齡的胎鼠,從特定組織中分離出細胞,在適宜條件下增殖培養(yǎng),直到它們占據(jù)所有可用的基質(zhì)(即達到匯合狀態(tài))的培養(yǎng)階段。在此階段,必須通過將細胞轉(zhuǎn)移到含有新鮮生長培養(yǎng)基的新容器中進行繼代培養(yǎng)(即傳代),以為其提供更多的繼續(xù)生長空間。


    用途


    1、藥物篩選實驗;
    2、信號通路與機制研究;
    3、生物制品的生產(chǎn)(如制備單克隆抗體)等 


    材料與儀器


    【儀器設備】超凈工作臺、濾器、CO2 培養(yǎng)箱、電熱干燥箱

    【器械及器皿】培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滴管、鑷子、手術(shù)剪

    【試劑】:常用培養(yǎng)基還有:DMEM-高糖、DMEM-低糖、DMEM/F12、RPM1640、MEM、M-199等,可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。

    血清:一般常用為胎牛血清,人血清和其它動物血清。

    平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體,維持細胞滲透壓,提供緩沖系統(tǒng),使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細胞生理范圍內(nèi),提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子等。常用的有PBS,Hank's 等。

    抗生素:常用為青霉素和鏈霉素。

    其它添加成分:緩沖系統(tǒng),常用為HEPES,在 20 度時為 7.55;37 度為7.31; HEPES 不是起維持 PH 恒定的作用,而是起恒定和抵抗快速 PH 變化的,所以調(diào)整 PH 常常用 NaHCO3 溶液。

    有機補充物,如丙酮酸鈉,谷氨酰胺等。促細胞分裂因子,如生長因子類的 FGF、EDF。貼璧和鋪展因子,如膠原蛋白,纖粘蛋白等。

    懷孕的母鼠、多聚賴氨酸、0.25% 胰酶、70-75% 酒精溶液


    步驟


    1、胚鼠原代培養(yǎng):

    1.1 實驗前,超凈工作臺或生物安全柜紫外燈提前照射 30 分鐘;

    1.2 取材:取懷孕母鼠,頸椎脫臼法處死后,整個鼠體浸入盛有純酒精的燒杯中浸泡 1 分鐘。取出母鼠在不銹鋼手術(shù)盤中用無菌手術(shù)剪打開腹腔,取出鼠胚,放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意取材可在無菌操作臺外操作。

    1.3 用 70-75% 酒精擦拭裝有鼠胚的培養(yǎng)皿外周后,將培養(yǎng)皿移至超凈工作臺或生物安全柜中,用含雙抗 Hanks 液洗滌鼠胚數(shù)遍卻除血污。在體視顯微鏡下進行操作,用無菌手術(shù)器械去除多余組織,用解剖鑷剖取需要的組織,移入含解離液或培養(yǎng)基的 50 ml 離心管中,用眼科剪將組織剪碎成1立方毫米的肉糜狀;

    1.4 在含組織的 50 ml 離心管中加入解離液或培養(yǎng)基至 10 ml。首先用 10 ml彎頭滴管對組織進行吹打 5-10 次,然后用 1 ml 槍頭的吹打組織,最后用 200 μl 的尖的一端進行吹打;

    1.5 將上述組織懸液通過 70 μm 過濾器過濾切碎和分散的組織懸浮液,然后 l200 rpm, 4℃ 離 10 分鐘;

    1.6 棄掉上清,加入配置好的細胞培養(yǎng)基重懸細胞,接種于經(jīng)多聚賴氨酸預處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中,將其置于于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中,三天后換液,以后每兩天換細胞培養(yǎng)液;

    2、傳代培養(yǎng)

    2.1 實驗前,超凈工作臺或生物安全柜紫外燈提前照射 30 min,開始實驗時,酒精擦拭消毒雙手;

    2.2 將原代培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),確定細胞是否需要傳代培養(yǎng);

    2.3 用酒精棉球擦凈操作臺,點燃酒精燈,將培養(yǎng)瓶口灼燒消毒;

    2.4 倒掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基,留下貼壁生長的細胞;

    2.5 在培養(yǎng)瓶中加入適量 0.25 % 胰酶至剛好漫過貼壁生長的細胞即可,擰上瓶蓋,將培養(yǎng)瓶置于37℃的培養(yǎng)箱中 5 min。在此期間,如果在顯微鏡下觀察可以看到細胞收回突起變成圓形。

    2.6 取出培養(yǎng)瓶,輕輕搖晃培養(yǎng)瓶或吹打使細胞脫離瓶壁,將細胞懸液移至離心管中,4℃、800 rpm離心 5 min;

    2.7 棄掉離心管中的上清,加入細胞培養(yǎng)基重懸細胞植于多聚賴氨酸預處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板,再將其置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),此時細胞可以繼續(xù)分裂而傳代。


    注意事項


    1、原代培養(yǎng)注意事項:

    1)原代培養(yǎng)要重點注意無菌操作,所用器械需提前高壓滅菌;

    2)因為鼠胚原代培養(yǎng)時,獲取組織較少,建議在冷光源體視顯微鏡下操作;

    3)原代細胞培養(yǎng)過程比較慢,培養(yǎng)時間最少需要一周以上的時間。若 2 天后可能會出現(xiàn)培養(yǎng)基變黃的現(xiàn)象,且無漂浮物,排除污染,屬于正常現(xiàn)象,這是因為細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2 和其他物質(zhì)導致培養(yǎng)液 PH 發(fā)生了改變,所以變黃;

    4)正常貼壁細胞在培養(yǎng)幾天后,會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底,呈現(xiàn)出相應的形狀,有的呈纖維狀,有的星多邊形;

    5)細胞的第一次傳代,一定要密度高一些傳代原代細胞傳代密度低,很難長起來。建議 1:2-13傳代如果細胞數(shù)量夠的條件下,P2-P3 代完成實驗是最合適的。如果細胞數(shù)量不夠,那細胞的提取和培養(yǎng)比較重要,盡可能地讓細胞的好狀態(tài)多維持幾代對實驗成敗來說至關重要;

    6)原代細胞不建議凍存,因為凍存很容易復活不成功。如果要凍存的話,建議在 P2或P3 代凍存,一些比較難復蘇的細胞可以適當提高凍存液中的血清濃度;

    7)很多原代細胞的體外培養(yǎng)需要加入生長因子,細胞才能正常的生長增殖和分化;

    2、細胞傳代注意事項:

    1)細胞離心時離心速度建議800-1000 rpm/min,4℃ 離心 5 分鐘,避免轉(zhuǎn)數(shù)過高,造成細胞破碎死亡;

    2)消化時,注意觀察,切勿消化過度;


    常見問題


    1、當在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)時發(fā)現(xiàn),多數(shù)細胞已經(jīng)失去分裂能力了,而好的細胞應該呈現(xiàn)長梭形,立體感強。因此,這些細胞不能用于傳代細胞的培養(yǎng)。

    2、理論上,在顯微鏡下可以觀察到梭形的細胞說明傳代培養(yǎng)成功。和原代培養(yǎng)的觀察類似。但是總的來說,我們實驗室的實驗結(jié)果不是很好,觀察到的好的細胞很少。其原因可能和原代培養(yǎng)時候的相近。

    3.對于不能進行傳代培養(yǎng)的細胞我們進行了活性的觀察實驗。

    用臺盼藍染液染色,取 9 滴細胞液加 1 滴臺盼藍,染色不超過 3 分鐘,在顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn),有的細胞核被染成藍色,而有的細胞核沒有著色。

    這是因為細胞核被染色的細胞是死細胞,而未被染色的則是活細胞,通過這個實驗可以計算視野中細胞的存活率。

    4、細胞增殖分化緩慢:有些原代細胞體外培養(yǎng)需要加入生長因子,細胞才可正常增殖和分化,因而,實驗前要根據(jù)具體細胞配置相應培養(yǎng)基;

    5、細胞污染:細胞污染類型分為:物理污染、化學污染以及生物污染,因而原代培養(yǎng)要嚴格無菌操作,培養(yǎng)基專用專配不要交叉使用;

    6、消化時,細胞長時間難以消化下來:胰酶使用前,需要在 37℃ 水浴鍋充分預熱,已達到最佳酶活性;


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