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    膠原酶解離組織

    發(fā)布時(shí)間： 2022-12-07　　點(diǎn)擊次數(shù)： 772次

    原理

    切碎的組織放于含有膠原酶的完-全培養(yǎng)基中孵育，組織分解后，通過離心去除膠原酶，高濃度接種、培養(yǎng)。

    材料與儀器

    膠原酶 DBSS
    培養(yǎng)基 移液器 皮氏平皿 培養(yǎng)瓶 離心管 手術(shù)刀 離心機(jī)

    步驟

    1. 將組織移人新鮮、無菌的 DBSS 中，淸洗。

    2. 轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿（9 cm 皮氏平皿，非組織培養(yǎng)級別），切除多余組織，如脂肪或壞死組織。

    3. 將組織轉(zhuǎn)移至第三個(gè)平皿中，用交叉的手術(shù)刀細(xì)切成大約 1 mm3 大小。

    4. 用 10~20 ml 廣口移液管將組織移入 15 ml 或 25 ml 無菌離心管或常用的容器， 中（先用 DBSS 濕潤移液管，否則組織塊易貼壁）。

    5. 讓組織塊沉降。

    6. 用 DBSS 重懸清洗組織，組織塊沉降后，去除上清液，重復(fù)此步驟兩次以上。

    7. 將 20~30 個(gè)組織塊接種于一個(gè) 25 cm2 的培養(yǎng)瓶中，另一瓶中接種 100~200 塊。

    8. 吸凈 DBSS，每瓶中加入 4.5 ml 含血清的培養(yǎng)基（如 DMEM/F12加10 % 胎牛血清）。

    9. 加入 0.5 ml 粗制膠原酶（2000 U/ml，Worthington CLS 或 Sigma 1A），終濃度為 200 U/ml。

    10. 于 37°C 培養(yǎng) 4~48 h，無需振蕩。腫瘤組織（如乳腺或結(jié)腸的硬癌）由于分解較慢，可作用 5 天或更長時(shí)間。有時(shí)由于時(shí)間過長 pH 過度下降（pH<6. 5），要將組織離心并用新的培養(yǎng)基和膠原酶重懸。

    11. 輕輕晃動培養(yǎng)瓶檢查分離情況：組織塊呈點(diǎn)狀分布于培養(yǎng)瓶底部，適當(dāng)吸打后分散成單一細(xì)胞或小的組織塊。

    12. 有些組織（肺、腎、結(jié)腸或乳腺癌）的部分上皮細(xì)胞小團(tuán)塊對膠原酶耐受，沉淀 2 min 即可與其他剩余組織分離。若將其用 DBSS 重懸，沉淀后將沉淀物接種于培養(yǎng)基中，將形成生長旺盛的上皮細(xì)胞島。上皮細(xì)胞往往在未完-全解離時(shí)存活較好。

    13. 完-全分解或組織塊沉降后，收集上清液中的細(xì)胞，于 50~100g 離心 3 min（離心管或常規(guī)容器，15~50 ml，依據(jù)處理組織的量而選擇） 。

    14. 去除 DBSS 或培養(yǎng)基上清液，重懸，加入 5 ml 培養(yǎng)基，接種于 25 cm2 培養(yǎng)瓶中。若膠原酶作用時(shí) pH 下降了（pH< 6.5 達(dá) 48 h )，去除膠原酶后用 2 倍或 3 倍培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液。

    15. 于 48 h 后更換培養(yǎng)基。


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