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    Feulgen反應(yīng)顯示細(xì)胞中DNA

    發(fā)布時(shí)間： 2023-01-13　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1628次

    簡(jiǎn)介

    Feulgen反應(yīng)由Feulgen在1924年發(fā)明，是一種傳統(tǒng)的、也是最為經(jīng)典的通過化學(xué)染色來特異性顯示細(xì)胞中DNA的方法。

    原理

    Feulgen反應(yīng)顯示細(xì)胞中DNA的基本原理是首先采用稀酸作用于DNA，使其脫去嘌呤堿，暴露出游離醛基，該醛基與Schiff試劑反應(yīng)生成紫紅色產(chǎn)物，細(xì)胞中存在有DNA的部位即呈現(xiàn)紫紅色陽性反應(yīng)。如圖3-1中所示，堿性品紅是紅色物質(zhì)，能與產(chǎn)生SO2的試劑作用形成無色產(chǎn)物，即Schiff試劑，它可以與DNA水解釋放出的醛基結(jié)合而氧化為紫紅色化合物。

    用途

    Feulgen 反應(yīng)顯示細(xì)胞中 DNA 既可檢測(cè)細(xì)胞或組織中 DNA 的存在部位及分布，也可利用其顯色強(qiáng)度與 DNA 含量成正比的特性，用于對(duì)細(xì)胞或組織中的 DNA 含量進(jìn)行測(cè)定。由于反應(yīng)對(duì)含有 DNA 的核結(jié)構(gòu)顯示細(xì)致、清晰，染色穩(wěn)定，有利于鑒別不同核結(jié)構(gòu)和分化程度的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞等。

    材料與儀器

    器材：

    尖頭鑷子、染色缸、蓋片、載玻片、吸管、吸水濾紙、普通光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、CO2培養(yǎng)箱、HeLa人宮頸癌上皮細(xì)胞。

    試劑：
    ①Hanks液


    （1）原液甲NaCl 160 g ，KC18 g ，MgSO4•7H2O2 g ；MgCl2•6H2O2 g ，溶于800 mL  蒸餾水中。CaCl2（無水）2.8 g ，溶于100 mL 蒸餾水中。將兩種液體混合后，加水至1000 mL ，用濾紙濾過，再加2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱備用。

    （2）原液乙 Na2HPO4•12H2O3.04 g ，KH2PO41.2 g ，葡萄糖20.0 g ，溶于800 mL 蒸餾水中，用濾紙過濾，然后加0.5％酚紅80 mL ，再加水至1000 mL ，最后加入2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱備用。
    （3）使用液甲乙兩液各1 份 ，雙蒸水18 份 ，混勻分裝，經(jīng)101 bf ／in （68.9 kPa ）15 min 高壓滅菌后置4 ℃ 冰箱中保存。臨用前用無菌的5.6％NaHCO3 調(diào)至所需 pH 值。）
    ②1 mol ／L 鹽酸
    ③Schiff 試劑
    （堿性品紅0.5 g 加入100 mL 煮沸的蒸餾水中，持續(xù)煮沸5 min ，并隨時(shí)攪拌，使之充分溶解。然后將其冷卻到50 ℃ ，過濾到棕色瓶中，加1 mol ／L  HC110 mL ，冷卻至25 ℃ 時(shí)加入1 g 無水亞硫酸氫鈉（NaHSO3），需充分振蕩后，避光過夜。次日取出（呈淡黃色），加0.25 g 活性炭劇烈振蕩1 min ，過濾后即得 Schiff 試劑，此時(shí)溶液應(yīng)完-全無色。避光、低溫、密封保存。用前應(yīng)事先取出使其恢復(fù)至室溫。）
    ④ Carnoy 固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1）
    ⑤0.5％亮綠
    ⑥蒸餾水
    ⑦70％乙醇
    ⑧80％乙醇

    ⑨95％乙醇


    ⑩無水乙醇
    ?二甲苯
    ?中性樹膠

    步驟

    Feulgen 反應(yīng)顯示細(xì)胞中 DNA 的基本過程可分為如下幾步：
    A.將培養(yǎng)的 HeLa 細(xì)胞接種于蓋片，24～48 h 后生長(zhǎng)為單層。
    B.取細(xì)胞蓋片1 張 ，用 Hanks 液（pH 7.2～7.4）漂洗3 次 ，吸水濾紙吸干液體。
    C.放入 Carnoy 固定液中固定30 min 。
    D.蒸餾水洗3 次 。
    E.將蓋片置于1 mol ／L 鹽酸中，60 ℃ 水浴水解10 min 。
    F.蒸餾水洗1 次 。
    G.將蓋片移入 Schiff 試劑中，暗處反應(yīng)30 min 。
    H.流水沖洗5 min 。
    I.蒸餾水洗3 次 。
    J.0.5％亮綠復(fù)染1～3 min 。
    K.70％乙醇→80％乙醇→95％乙醇→無水乙醇梯度脫水。
    L.蓋片浸入二甲苯中透明5 min 。
    M.滴1 滴 中性樹膠于載玻片上，將蓋片細(xì)胞面朝下封片。
    N.鏡下觀察。

    注意事項(xiàng)

    1.本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是有效地控制DNA水解的程度，包括稀酸的濃度，水解的時(shí)間、溫度等。水解不足，會(huì)使游離醛基的暴露不完-全，反應(yīng)變?nèi)?；水解過度，會(huì)導(dǎo)致 DNA 異常降解，也同樣使反應(yīng)變?nèi)?，染色深度下降，?yán)重時(shí)出現(xiàn)陰性反應(yīng)。一般的水解時(shí)間應(yīng)控制在10～15 min ，同時(shí)應(yīng)考慮不同標(biāo)本材料的影響。
    2. Schiff 試劑的質(zhì)量也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素，試劑暴露于空氣中易被氧化而變成紅色，使試劑失效。操作及保存中不宜過多暴露于空氣，并應(yīng)注意避光。
    3.本實(shí)驗(yàn)采用蓋片培養(yǎng)細(xì)胞，因此在整個(gè)操作過程中，應(yīng)注明蓋片的正反面，防止破壞細(xì)胞面，尤其在進(jìn)行流水沖洗步驟時(shí)，應(yīng)避免水流直接接觸細(xì)胞面。


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