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    DNA復(fù)制的藝術(shù):PCR技術(shù)的演變史

    發(fā)布時(shí)間: 2024-03-01  點(diǎn)擊次數(shù): 596次

    按照PCR技術(shù)的演進(jìn),我們可以將PCR技術(shù)大致劃分為三代:傳統(tǒng)PCR技術(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)。

    第一代:傳統(tǒng)PCR技術(shù)

    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基本原理是利用DNA聚合酶在特定條件下復(fù)制特定DNA片段,通過(guò)反復(fù)的循環(huán),這個(gè)特定的DNA片段可以被大量復(fù)制或放大。PCR過(guò)程主要包括以下三個(gè)步驟:

    • 變性(Denaturation)在高溫(通常為94-96°C)下,DNA雙鏈被分離成兩條單鏈。這是因?yàn)镈NA雙鏈之間的氫鍵在高溫下會(huì)斷裂。

    • 退火(Annealing)降低溫度(通常在50-65°C),使得人工合成的、與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的短DNA片段(即引物)能夠與分離后的DNA單鏈結(jié)合。

    • 延伸(Extension)高溫度(通常為72°C),DNA聚合酶開(kāi)始在引物的末端添加相應(yīng)的核苷酸,以此按照DNA的互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制DNA。

    這種“變性—退火—延伸"就是一個(gè)PCR循環(huán),每個(gè)循環(huán)都會(huì)使目標(biāo) DNA 序列的數(shù)量翻倍。使得DNA片段在短時(shí)間內(nèi)能以2n倍進(jìn)行擴(kuò)增,這樣就可以生成數(shù)百萬(wàn)到數(shù)十億份的目標(biāo) DNA 序列。PCR的反應(yīng)流程大致如下:

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    傳統(tǒng)的PCR技術(shù)通常試管內(nèi)進(jìn)行,這個(gè)過(guò)程通常被反復(fù)進(jìn)行30-40次,每次循環(huán)都會(huì)使目標(biāo)DNA序列的數(shù)量翻倍。這樣,即使開(kāi)始時(shí)只有極少量的目標(biāo)DNA,也可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)得到足夠數(shù)量的DNA片段。并且需要人工改變每個(gè)循環(huán)的溫度變化,過(guò)程耗時(shí)且容易出錯(cuò)。

    然而,傳統(tǒng)的PCR技術(shù)也有一些局限性。例如,它不能提供關(guān)于目標(biāo)DNA數(shù)量的實(shí)時(shí)信息,也不能進(jìn)行精確的定量分析。

    第二代:實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)
    傳統(tǒng)的PCR技術(shù)主要用于定性檢測(cè),即判斷目標(biāo)DNA序列是否存在。但在許多研究和應(yīng)用中,人們需要知道目標(biāo)DNA的具體數(shù)量,例如在基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)、基因編輯效率評(píng)估等場(chǎng)景。因此傳統(tǒng)的PCR技術(shù)通常需要在反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)電泳或其他方法來(lái)檢測(cè)和分析結(jié)果,這大大增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和時(shí)間。為了解決這一問(wèn)題,實(shí)時(shí)熒光PCR問(wèn)世了。實(shí)時(shí)熒光PCR是一種革新性的DNA定量技術(shù),其基本原理與傳統(tǒng)的PCR相同,都是通過(guò)熱循環(huán)引發(fā)DNA的去鏈和復(fù)制。然而,實(shí)時(shí)熒光PCR的特別之處在于,在PCR過(guò)程中,反應(yīng)體系中添加了能夠發(fā)射熒光信號(hào)的熒光標(biāo)記物,使得PCR的擴(kuò)增過(guò)程能夠被實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

    新一代的熒光標(biāo)記物如SYBR Green,其與雙鏈DNA(dsDNA)的結(jié)合能力遠(yuǎn)超過(guò)溴化乙二胺,能產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。這種特性不僅提升了PCR檢測(cè)的靈敏度,而且有助于縮短PCR實(shí)驗(yàn)的總體周期。在PCR過(guò)程中,每當(dāng)DNA分子被復(fù)制一次,SYBR Green就會(huì)與新產(chǎn)生的DNA分子結(jié)合,發(fā)射出熒光信號(hào)。因此,熒光信號(hào)的強(qiáng)度就可以直接反映出當(dāng)前擴(kuò)增的DNA數(shù)量。

    但SYBR Green又有新的問(wèn)題,那就是無(wú)法區(qū)分不同的DNA序列。針對(duì)需要高特異性檢測(cè)的場(chǎng)合,研究者們開(kāi)發(fā)了一系列與特定DNA序列結(jié)合的熒光探針,如雙標(biāo)記探針(TaqMan探針)、分子信標(biāo)、Scorpions探針和LightCycler探針等。這些探針的設(shè)計(jì)原理是,一端連接熒光染料(reporter),另一端連接猝滅劑(quencher)。在PCR反應(yīng)中,這些探針會(huì)與目標(biāo)DNA序列特異性結(jié)合,由于熒光染料和猝滅劑距離近,熒光會(huì)被猝滅。然而,當(dāng)DNA聚合酶在延伸新的DNA鏈時(shí),它會(huì)分解探針,使熒光染料與猝滅劑之間的距離增大,從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。

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    第三代:數(shù)字熒光PCR

    數(shù)字PCR(DigitalPCR,dPCR)的發(fā)展源于對(duì)更準(zhǔn)確、更靈敏的分子檢測(cè)方法的需求。雖然實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域,但是它存在一些局限性,比如需要標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,對(duì)樣本純度和PCR效率有較高的要求,而且對(duì)于罕見(jiàn)突變和低豐度目標(biāo)分子的檢測(cè)靈敏度不夠。

    數(shù)字PCR(dPCR)是一種新型PCR技術(shù),它通過(guò)將樣品稀釋并分配到數(shù)百到數(shù)百萬(wàn)個(gè)微小的反應(yīng)室中,每個(gè)反應(yīng)室中包含零個(gè)或一個(gè)模板拷貝。然后在每個(gè)反應(yīng)室中獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng),并通過(guò)檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)室的熒光信號(hào)來(lái)確定是否存在目標(biāo)分子。這種方法可以直接計(jì)算出樣品中的目標(biāo)分子數(shù)量,而不需要像qPCR那樣依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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    數(shù)字PCR是一種精確且敏感的分子生物學(xué)技術(shù),專(zhuān)門(mén)用于測(cè)量DNA或RNA的數(shù)量。其主要優(yōu)勢(shì)在于具有高精度和高靈敏度,能夠直接計(jì)算樣品中的目標(biāo)分子數(shù)量,并對(duì)低豐度的目標(biāo)分子進(jìn)行高效檢測(cè)。并且數(shù)字PCR不需要依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因,這減少了實(shí)驗(yàn)偏差,使其能夠在復(fù)雜樣本中準(zhǔn)確地進(jìn)行定量。但數(shù)字PCR也有缺點(diǎn),其中包括實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性、設(shè)備成本高昂,以及相對(duì)較低的樣本處理能力。

    小結(jié)

    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)自1983年發(fā)明以來(lái),已逐漸成為生命科學(xué)研究和臨床分子診斷領(lǐng)域的核心技術(shù)。PCR技術(shù)的發(fā)展歷程經(jīng)歷了傳統(tǒng)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)以及數(shù)字PCR(dPCR)三個(gè)重要階段,每個(gè)階段的技術(shù)突破和優(yōu)化都為DNA的檢測(cè)和分析提供了更準(zhǔn)確、更靈敏和更高效的解決方案。

    PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用不僅深刻地改變了生命科學(xué)研究的面貌,而且在臨床診斷、環(huán)境和食品安全監(jiān)測(cè)、藥物發(fā)現(xiàn)以及藥物療效監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而,盡管PCR技術(shù)已經(jīng)取得了顯著的成就,但在提升PCR技術(shù)的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,以及降低PCR實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和成本等方面,我們?nèi)悦媾R著一些挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn),科學(xué)家們正在進(jìn)行大量的研究工作,并已經(jīng)取得了一些重要的突破。我們有理由相信,隨著科技的進(jìn)步,PCR技術(shù)將在未來(lái)的生命科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用,為人類(lèi)社會(huì)帶來(lái)更多可能性和福祉。

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